Шифф йодная кислота

Шифф йодная кислота

ГИСТОХИМИЯ УГЛЕВОДОВ

Биологическая роль углеводов многообразна.

В организме они выполняют опорные и энергетические функции, некоторые углеводы являются составными частями биологически важных соединений (АТФ, циклической АМФ, нуклеиновых кислот, гепарина, витамина С и др.). Гликопротеиды как специфический компонент иммуноглобулинов играют важную роль в иммунных механизмах, определяя антигенную активность сывороточных и клеточных факторов. Кроме того, продукты расщепления углеводов используются для синтеза практически всех классов соединений в живой клетке.

Классификация углеводов

В живой клетке углеводы существуют в форме моно-, олиго- и полисахаридов. В гистологических препаратах они сохраняются практически только в виде полисахаридов: во всяком случае только полисахариды могут быть с достоверностью выявлены гистохимически. Правда, возможно также гистохимическое выявление глюкозы и витамина С.

Общепринятой классификации полисахаридов не существует.

Для практических гистохимических целей достаточно разделить полисахариды на гомо- и гетерополисахариды.

Гомополисахариды построены из остатков молекул моносахаридов, главным образом пентозы и гексозы, соединенных между собой кислотными мостиками. Гомополисахаридами являются крахмал, инулин, клетчатка, гликоген. К ним с определенными оговорками можно также отнести хитин и полигалактуроновую кислоту.

Гетерополисахариды разделяют на гликозаминогликаны (ГАГ) и гликопротеины. К кислым гликозаминогликанам ГАГ относят гиалуроновую кислоту, молекула которой построена из остатков глюкуроновой и уксусной кислот и гексозамина; хондроинин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, гепаритин-сульфат, гепарин, молекулы которых содержат остатки гексозамина, глюкуроновой или уроновой кислот, серной и уксусной кислот в различных сочетаниях. В тканях кислые ГАГ, кроме гепарина, находятся в соединении с белками. Такие комплексы, в которых к белковому стержню присоединены полисахаридные цепи, носят название «протеогликаны». Все эти соединения входят в состав матрикса соединительной ткани, крови, синовиальной жидкости, слизи.

Гликопротеины являются белками, к молекуле которых ковалентно присоединены олигосахариды: гексозы, гексозамины, сиаловые кислоты, фукозы и др. Такие соединения являются составной частью клеточных мембран, слизистых секретов желез, сывороточных белков, ферментов, гормонов, «неколлагеновых белков» соединительной ткани и т.д.

Гистохимическая идентификация углеводов

Выявление углеводов основано, как правило, на методах общего анализа химических групп. Используются методы окисления, метахроматическое окрашивание основными красителями, реакции связывания коллоидных металлов, выявление базофилии, окрашивание кармином, реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп, методы ферментативного гидролиза, радиоавтографию, иммуногистохимию.

Методы окисления 1,2-гликолей до альдегидов

Реакция Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция)

Метайодная кислота селективно окисляет и расщепляет -С=С-связи не только в 1,2-окси-, но также в 1-окси-2-амино-1-окси-2-алкиламино- и 1-окси-2-кетогруппах.

В результате этого образуется одна кетогруппа или две альдегидные группы, как, например, в глюкозе. Альдегидные группы реагируют с реактивом Шиффа (фуксин-сернистой кислотой) точно так же, как и в реакции Фельгена. С помощью этого метода выявляют все соединения, содержащие оксигруппы, которые в результате окисления метайодной кислоты могут превращаться в альдегидные группы. Однако в гистологических срезах практически лишь гликоген и гликопротеины, сохраняющиеся в достаточных количествах, могут быть выявлены с помощью ШИК-реакции. Гликоген можно дифференцировать от гликопротеинов путем переваривания в амилазе или диастазе.

Для окисления -С-С-связей в полисахаридах предпринимались попытки использовать, помимо одной кислоты, другие окислители-хромовую кислоту, перманганат калия, тетраацетат натрия и т.д. Наиболее удачной является модификация ШИК-реакции, предложенная А.Л. Шабадашем (1949).

1. Материал фиксируют в 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Ценкера, заливают в парафин.

Читайте также:  Чем питаются бактерии в организме человека

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллирован­ной воды.

3. При комнатной температуре срезы окисляют 0,5—1 % водным раствором орто- или метайодной кислоты в течение 2 —10 мин.

Окисление можно также проводить по Шабадашу в 0,001—0,01 М метаперйодате калия или натрия в течение 7 — 25 мин.

Раствор хранят в темноте.

Рабочую концентрацию этого раствора и продолжительность инкубации в ней подбирают в зависимости от объекта.

4. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.

5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 10-30 мин при комнатной температуре в темноте.

Реактив Шиффа по Грауманну:

0,5 г парарозанилина (парафуксин, свободный от акридина, стандартный) полностью растворяют в 15 мл 1 н. соляной кислоты без нагревания при помешивании и доводят до 85 мл дистиллированной водой с растворенными в ней 0,5 г пиросульфита калия; прозрачный интенсивно-красный раствор, помещенный в темноту в сосуде с плотно прилегающей пробкой, в течение 24 ч приобретает желтоватый оттенок, его встряхивают 2 мин с 0,3 г активированного угля (порошок) и затем дважды фильтруют.

Такой раствор готов к использованию и его можно хранить в сосудах коричневого цвета с пришлифованной пробкой по крайней мере в течение 2 мес.

6. Срезы промывают сернистой водой (600 мл дистиллированной воды + 30 мл 10 % пиросульфита калия + 30 мл 1 н. со­ляной кислоты) три раза по 2 мин.

Сернистую воду можно так­же готовить (непосредственно до проведения реакции) по рекомендации А.Л. Шабадаша следующим образом:

к 200 мл дистиллированной воды добавить 10 мл 10 % раствора натрия гидросульфита

и 10 мл 1 н. соляной кислоты.

7. Тщательно промывают в проточной и дистиллированной воде, ядра можно докрасить 0,5 % светлым зеленым или кислым гемалауном.

8. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам.

углеводы, содержащие гексозу, окрашиваются в красно-лиловый цвет, гликоген — в более интенсивный темно-красный.

расщепление гликогена амилазой или диастазой, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп.

необходимо пользоваться химически чистой посудой, стеклянными палочками; нельзя работать с металлическими крючками или иголками; окрашивание срезов в реактиве Шиффа следует проводить в темноте.

Метахроматическое окрашивание кислых гликозаминогликанов

Метахромазия — это изменение спектров поглощения используемых красителей.

Метахромазию можно получить при использовании очень широкого набора красителей (табл. 2).

Спектры поглощения красителей, дающих метахромазию [Kel­ly, 1956]

Периодная кислота – Шифф ( PAS ) — это метод окрашивания, используемый для обнаружения в тканях полисахаридов, таких как гликоген , и слизистых веществ, таких как гликопротеины , гликолипиды и муцины. Реакция периодической кислоты окисляет вицинальные диолы в этих сахарах , обычно разрывая связь между двумя соседними атомами углерода, не участвующими в гликозидной связи или замыкании кольца в кольце моносахаридных единиц, которые являются частью длинных полисахаридов, и создавая пару из альдегидов на два свободных концах каждого сломанного моносахаридакольцо. Условия окисления должны в достаточной мере регулироваться, чтобы не окислять альдегиды в дальнейшем. Эти альдегиды затем реагируют с реактивом Шиффа, давая пурпурно-пурпурный цвет. Подходящее базовое пятно часто используется как контрастное пятно .

• Окраска диастазы PAS (PAS-D) — это окраска PAS, используемая в сочетании с диастазой , ферментом , расщепляющим гликоген.

Читайте также:  Кислотный пилинг дома отзывы

• Альциановый синий / периодическая кислота — Шифф (AB / PAS или AB-PAS) использует альциановый синий перед шагом PAS.

Содержание

  • 1 Использует
  • 2 Смотрите также
  • 3 Ссылки
  • 4 внешние ссылки

Использует

Окрашивание PAS в основном используется для окрашивания структур, содержащих высокую долю макромолекул углеводов ( гликоген , гликопротеин , протеогликаны ), обычно обнаруживаемых, например, в соединительных тканях , слизи , гликокаликсе и базальных пластинках .

Окрашивание PAS может использоваться для диагностики нескольких заболеваний:

  • Болезнь накопления гликогена (по сравнению с другими нарушениями накопления).
  • Аденокарциномы , которые часто выделяют нейтральные муцины.
  • Болезнь Педжета груди .
  • Саркома альвеолярной мягкой части .
  • Окрашивание макрофагов при болезни Уиппла .
  • Его можно использовать для диагностики дефицита α1-антитрипсина при положительном окрашивании перипортальных гепатоцитов печени.
  • Агрегаты PAS-положительных лимфоцитов присутствуют в эпидермисе при грибковом микозе и синдроме Сезари , которые называются микроабсцессами Путрие.
  • Саркома Юинга
  • Эритролейкоз , лейкоз незрелых эритроцитов. Эти клетки окрашивают в яркий фуксию.
  • Легочный альвеолярный протеиноз .
  • Грибковаяинфекция , клеточные стенки грибов окрашиваются в пурпурный цвет; это работает только с живыми грибами. В отличие от этого, окрашивание метенамином серебра (GMS) Grocott окрашивает как живые, так и мертвые грибковые организмы.
  • Он используется для определения гликогена в образцах биопсии легких у младенцев с легочным интерстициальным гликогенозом (PIG).
  • Его можно использовать для выделения суперсшитых липидных включений при цероидном липофусцинозе (NCL).

Присутствие гликогена можно подтвердить на срезе ткани, используя диастазу для переваривания гликогена из среза, а затем сравнивая срез PAS, расщепленный диастазой, с нормальным срезом PAS. Слайд с отрицательной диастазой покажет пурпурное окрашивание там, где гликоген присутствует в срезе ткани. На предметном стекле, обработанном диастазой, не будет положительного окрашивания PAS в тех местах на предметном стекле.

Окрашивание PAS также используется для окрашивания целлюлозы . Одним из примеров может быть поиск имплантированных медицинских устройств, состоящих из неокисленной целлюлозы.

Если окрашивание PAS будет производиться на ткани, рекомендуемым фиксатором будет 10% формалин с нейтральным буфером или раствор Буэна . Для мазков крови рекомендуемый фиксатор — метанол . Глутаральдегид не рекомендуется, поскольку свободные альдегидные группы могут вступать в реакцию с реагентом Шиффа , что может привести к ложноположительному окрашиванию.

Цитохимические методы преследуют отождествление химических и ферментных веществ в клетках, используя для этого цветные реакции. Цитохимические препараты сохраняют клеточную структуру, что допускает выявление клеток и внутриклеточную локализацию исследувмого составного. Вот почему в гематологии отдается предпочтение не биохимическим, трудоемким, разрушающим клеточную структуру о относящимся к весьма разнородной клеточной популяции, а цитохимическим способам.

Цитохимия доказала, что среди морфологически одинаковых клеток имеются существенные химические и ферментативные различия.

Гликоген (реакция ШИК) (PAS) — метод Гочкисс — Мак Минус

Принцип ШИК-реакции. Полисахариды выявляются путем реакции, окисляющей спиртные группы, которые преобразуются в альдегидные группы, и отождествления последних путем цветной реакции реагентом Шифф.

Реагенты для ШИК-реакции: 1. Закрепляющий смесь спирт-формалин: 9 частей абсолютного этилового спирта +1 часть 40% формалина; сохранять при температуре +4°.

2. Периодння кислота, 1% водный раствор. Раствор бесцветный. Хранить в бутылке из коричневого стекла, в темноте, при лабораторной температуре. Пожелтевший раствор неприменим.

Читайте также:  Как проходит осмотр у терапевта

3. Реагент Шиффа. Развести 1 г основного фуксина в 200 мл дистилированной воды при температуре кипения. Болтать 5 минут, охладить до температуры 50°, профильтровать и добавить 20 мл нормальной соляной кислоты. Охладить до 25°, добавить 2 г метабисульфита натрия или калия, которые полностью обеспечивают раствор. Раствор должен простоять сутки в условиях темноты и холода (+4°). Затем добавить 2 г активированного угля, поболтать 1 мин. и профильтровать.
Полученный фильтрат прозрачный и бесцветный. Допускается слегка желтоватый оттенок; если раствор розовеет, становится неприменимым. Хранить при температуре +4° в герметически закрытой бутылке из коричневого стекла.

4. Зеленый светлый —1% водный раствор.

5. Диастаз: неразжиженная слюна человека или 0,1% раствора амилолитического-диастатического фермента в физиологическом солевом растворе.

Техника проведения ШИК-реакции

1) 10-тиминутное закрепление мазков смесью спирт-формалин; промывание дистилированной водой;
2) окисление 1% раствором периодной кислоты, 10 мин.; промывание дистилированной водой;
3) окраска реагентом Шиффа в накрытой посуде, в условиях темноты и холода, в течение 2 часов; промывание проточной водой;
4) контрастная окраска 1% зеленым-светлым в течение 1 минуты; промывание проточной водой.

Контрольный закрепленный мазок подвергается инкубации диастазом, 60 мин. в условиях комнатной температуры для выборочного удаления гликогена. После промывания дистилированной водой подвергается обработке по обычному методу.

Оценка результатов ШИК-реакции

Гликоген, окрашенным в багряно красный- цвет, представляется в виде зерен или рассеянный. Для контроля реакции используются зрелые гранулоциты мазка. Помимо гликогена ШИК положительную реакцию дают и другие вещества углеводной природы, такие как, муцин, мукопротеины, цереброзиды, фибрин. Дифференциация гликогена от этих составных осуществляется путем предварительной обработки диастазом, после чего гликоген более не окрашивается.

В гранулоцитах гликоген находится в рассеянном виде уже на стадии промиелоцита и начинает увеличиваться по мере созревания. В нормальных условиях лимфоциты отрицательны или в 20% из них могут находиться несколько мелких зерен гликогена. Моноциты отрицательные либо имеют тонкую зернистость.

Интенсивность окраски определяется полуколичественно. В лимфоцитах реакция ШИК отражается в виде гликогенного показателя, или среднего показателя реакции (Астальди). Нормальный показатель гликогена колеблется в пределах от 0,10 до 0,30. Обычно лишь у патологических лимфоцитов наблюдается степень нагрузки более 3.

Значилось метода ШИК-реакции:
а) При постановке дифференциального диагноза отдельных цитологических видов острой лейкемии:
— Миелобласты и промиелоуиты ШИК-отрицательные или приобретают слабую диффузную окраску. Тела Ауера дают положительную реакцию, которая ослабевает после переваривания со слюной.
— Лимфобласты при острой лейкемии и лимфосаркоме дают резкую ШИК-положительную реакцию в виде зерен или крупных блоков гликогена.
— Эритробласты при эритремии и острой эритролейкемии дают резко положительную рассеянную или зернистую реакцию, в противоположность нормальным эритробластам, которые ШИК-отрицательные;
— Моноцитоидные б ласты непостоянно слабо положительные, с тонкой зернистостью.

б) В целях постановки диагноза и наблюдения за эффективностью лечения при хронической лимфатической лейкемии: завышенный показатель гликогена указывает на тяжелую форму заболевания и тяжкий прогноз.
Рост гликогена в патологических лимфоцитах не характерное для лейкемии явление, оно объясняется ростом метаболической активности при любом виде лимфоидной пролиферации.

в) Для дифференциации клеток Гоше от иных макрофагов с накоплением.

Ссылка на основную публикацию
Шифр мкб киста почки
ХБП 4 стадии, повреждение почек с выраженным снижением СКФ (15-29 мл/мин) ХБП 5 стадии, хроническая уремия, терминальная стадия заболевания почек...
Шарик на шее с правой стороны
Шишки на шее напрягают и пугают, хотя часто в них нет ничего опасного. Рассказываем, чем может оказаться простая шишка, как...
Шарик с кровью на десне
Уплотнение на десне может иметь различную природу. В большинстве случаев шишка появляется из-за плохой гигиены полости рта и со временем...
Шифф йодная кислота
ГИСТОХИМИЯ УГЛЕВОДОВ Биологическая роль углеводов многообразна. В организме они выполняют опорные и энергетические функции, некоторые углеводы являются составными частями биологически...
Adblock detector